多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號: BC2665

規(guī)格:100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：若溶液中有晶體析出，37℃水浴溶解；

2、 試劑二：臨用前加入10 mL蒸餾水，60℃水浴助溶；

3、 標準品：10mg半乳糖醛酸。臨用前加入0.943 mL蒸餾水，配成50 μmol/mL的標準液；

產(chǎn)品說明：

多聚半乳糖醛酸酶（Ploygalacturonase，PG）屬果膠酶的一種，廣泛存在于植物、細菌及真菌中。其催化多聚半乳糖醛酸分解，在果實軟化、花粉授粉、種子發(fā)育成熟及器官脫落等方面具有重要作用，并且病原菌在侵染宿主植物時，可分泌多聚半乳糖醛酸酶來降解宿主細胞壁，進而導(dǎo)致病程發(fā)展。

PG水解多聚半乳糖醛酸生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸與DNS試劑反應(yīng)生成在540 nm有特征吸收峰的棕紅色物質(zhì)，測定540 nm處吸光值變化可計算得果膠酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫臺式離心機、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1 : 5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，16000 g，離心10 min，取上清置于冰上待測。

細菌：先收集細菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬個細菌加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細菌（功率200 W，超聲3 s，間隔7 s，總時間5 min）；然后4℃，16000 g，離心10 min取上清置于冰上待測。

液體：直接檢測或用提取液稀釋后檢測。

二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 將50 μmol/mL 標準液用蒸餾水稀釋為6、5、4、3、2、1.5 μmol/mL的標準溶液備用。

3. 操作表：（在1.5mL離心管中）

三、PG酶活計算

1. 標準曲線的繪制：

以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y= kx+b，將ΔA帶入方程得到x（µmol/mL）。

2. PG酶活的計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算

酶活定義：在40℃，pH 6.0的條件下，每毫克蛋白每小時分解多聚半乳糖醛酸產(chǎn)生 1 μmol 的半乳糖醛酸定義為一個酶活力單位。

PG酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T = 0.5x÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：在40℃，pH 6.0的條件下，每克樣本每小時分解多聚半乳糖醛酸產(chǎn)生 1 μmol 的半乳糖醛酸定義為一個酶活力單位。

PG酶活（U/g 質(zhì)量）= x×V提取÷W÷T = 0.5x÷W

（3）按照細菌數(shù)量計算

酶活定義：在40℃，pH 6.0的條件下，每104個細菌每小時分解多聚半乳糖醛酸產(chǎn)生 1 μmol 的半乳糖醛酸定義為一個酶活力單位。

PG酶活（U/10⁴ cell）= x×V提取÷T÷細菌數(shù)量（萬個）=0.5x÷細菌數(shù)量（萬個）

（4）按液體體積計算

酶活定義：在40℃，pH 6.0的條件下，每mL樣本每小時分解多聚半乳糖醛酸產(chǎn)生 1 μmol 的半乳糖醛酸定義為一個酶活力單位。

PG酶活（U/mL）= x×V樣÷V樣÷T = 0.5x

V提取：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.025 mL；T：酶促反應(yīng)時間，2 h。

注意事項：

1、 樣本提取上清液置于冰上待測，且樣本提取完成后建議當(dāng)天提取當(dāng)天內(nèi)測完。

2、 當(dāng)A大于2時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定，并在計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

3、 植物果實組織建議將樣本稀釋10倍或20倍后再測定。

4、 若樣本ΔA值偏小，建議延長酶促反應(yīng)時間，并在計算公式中除以相應(yīng)時間。

實驗實例：

1、 取0.1g木槿花加入1mL提取液冰浴勻漿后于4℃，16000 g，離心10 min，取上清稀釋2倍后按照測定步驟操作，用微量石英玻璃比色皿測得計算ΔA=A測定管-A對照管=1.6843-1.4916=0.1927，帶入標準曲線y=0.2426x-0.2979，計算得x=2.022µmol/mL，按樣本質(zhì)量計算：

PG酶活（U/g質(zhì)量）= 0.5x÷W×2（稀釋倍數(shù)）=20.22 U/g質(zhì)量。

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